La Cromatografía Liquida…

La Cromatografía Liquida…

1. Introducción

Esta página web pretende introducir información básica sobre la cromatografía líquida y los productos Shodex ™. La explicación utilizada aquí es simple y fácil de entender, por lo que las palabras utilizadas pueden no ser apropiadas para referencias científicas.

2. ¿Qué es la cromatografía líquida?

La historia de la Cromatografía Líquida comenzó a principios del siglo XX. En 1906, un botánico ruso Mikhail Tswett inventó LC para separar varios pigmentos vegetales. Inyectó el extracto de la planta y el éter de petróleo a través de una columna de vidrio llena de carbonato de calcio.

Puesto que esto se hizo en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la columna. Al principio, sólo hay una capa de pigmento en la parte superior de la columna (Figura 1.a). Pero a medida que pasa el tiempo, el pigmento se separa en cuatro capas de colores diferentes (Figura 1.b). La investigación posterior descubrió que esas cuatro capas eran (i) verde azulado; Clorofila a, (ii) verde amarillento; Clorofila b, (iii) amarillo; Xantina, y (iv) naranja; caroteno. Todo el proceso de separación tardó varias horas y por lo tanto no era un método muy práctico. Este largo tiempo de análisis fue parte de la razón por la que LC no se convirtió en una herramienta analítica popular hasta 1970, medio siglo después de la invención de Mikhail Tswett. A continuación se presentan algunos términos comúnmente utilizados en el análisis de cromatografía.

La cromatografía es una técnica de separación y la palabra cromatografía se originó a partir de croma que significa “color” y grafina que significa “escribir”. El cromatógrafo es el equipo de separación y el cromatograma es un gráfico de salida obtenido del análisis.

3. ¿Qué es la HPLC?

HPLC significa Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Antes de que la HPLC estuviera disponible, el análisis LC se llevó a cabo mediante flujo gravitatorio del eluyente (el disolvente utilizado para el análisis LC) requirió así varias horas para que el análisis se completara. Incluso las mejoras añadidas en el tiempo posterior fueron capaces de acortar ligeramente el tiempo de análisis. Aquellos sistemas clásicos / LC iniciales se denominan “cromatografía de baja presión” o “cromatografía en columna”.

En los años 70 en los Estados Unidos, Jim Waters fundó Waters Corporation y comenzó a vender instrumentos de HPLC. Esto promovió el uso de la HPLC en áreas de análisis práctico. Los sistemas de LC que Waters Corporation desarrolló utilizaron una bomba de alta presión que genera un flujo rápido de eluyente y, por lo tanto, dio lugar a una mejora espectacular en el tiempo de análisis. En comparación con la “cromatografía de baja presión”, los nuevos tipos se denominaron “cromatografía líquida de alta presión”. Por lo tanto, se utilizó para pensar que la HPLC significa Cromatografía Líquida de Alta Presión, sin embargo hoy en día es un acuerdo común que la HPLC significa Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Otro gran cambio de la fecha de Tswett fueron los métodos de adquisición de datos. En lugar de observar los cambios de las capas por los ojos, el sistema detector se acopló a la LC y la salida se registró en la carta de papel. Si tuviéramos que demostrar el resultado del análisis de Tswett en un gráfico (chromatogramm)

1. Naranja 2. Amarillo 3. Amarillo Verde 4. Azulado Verde
Figura 3. Representación del análisis LC de Tswett.

Inicialmente, el sistema de HPLC fue referido al sistema de Waters Corporation. Todavía ahora, Waters Corporation es el pionero de HPLC, pero hay varias otras compañías que fabrican y venden sistemas de HPLC.

Técnicamente hablando, la palabra LC representa toda la cromatografía líquida, incluyendo LC de baja presión, sin embargo la mayoría de los sistemas de LC usados en estos días son HPLC, por lo tanto, la palabra LC se utiliza como comparable a HPLC.

 

4. Componentes de la HPLC

El sistema típico de HPLC consta de los siguientes (Figura 4). Los detalles de cada uno se explican a continuación.

4.1 Bomba
En el estado anterior de desarrollo de HPLC, la bomba era la parte más importante del sistema. El desarrollo de la HPLC se puede decir que fue un desarrollo del sistema de bombeo. La bomba se sitúa en la corriente más superior del sistema LC y genera un flujo de eluyente desde el depósito de disolvente al sistema. En la etapa anterior del desarrollo de LC, ser capaz de generar la alta presión fue uno de los requisitos de sistema más importantes. Sin embargo, hoy en día, la generación de alta presión es un requisito “estándar” y lo que más preocupa hoy en día es ser capaz de proporcionar una presión consistente en cualquier condición, para proporcionar un caudal controlable y reproducible. Dado que un cambio en el caudal puede influir en el análisis en gran medida.
La mayoría de las bombas usadas en los sistemas LC actuales generan el flujo por movimiento de vaivén de un pistón accionado por motor (bombas alternas). Debido a este movimiento del pistón, produce “pulsos”. Ha habido grandes mejoras en el sistema para reducir esta pulsación y las bombas recientes crean mucho menos pulso en comparación con las más antiguas. Sin embargo, el análisis reciente requiere una sensibilidad muy alta para cuantificar una pequeña cantidad de analitos, y por lo tanto, incluso un pequeño cambio en el caudal puede influir en el análisis. Por lo tanto, las bombas requeridas para el análisis de alta sensibilidad deben ser muy precisas.

4.2 Inyector
Un inyector se coloca junto a la bomba. El método más sencillo es usar una jeringa, y la muestra se introduce en el flujo del eluyente. Dado que la precisión de la medición LC es afectada en gran medida por la reproducibilidad de la inyección de la muestra, el diseño del inyector es un factor importante. El método de inyección más utilizado se basa en los bucles de muestreo. El uso del sistema de auto-inyector (auto-inyector) también es ampliamente utilizado que permite inyecciones repetidas en un calendario programado.

4.3 Columna
La separación se realiza dentro de la columna; Por lo tanto, se puede decir que la columna es el corazón de un sistema LC. La teoría de la columna de cromatografía no ha cambiado desde el tiempo de Tswett; Sin embargo ha habido una mejora continua en el desarrollo de columnas. Las columnas recientes se preparan a menudo en carcasa de acero inoxidable, en lugar de columnas de vidrio utilizadas en el experimento de Tswett. El material de envasado usado generalmente es gel de sílice o polímero en comparación con el carbonato de calcio usado por Tswett.

El eluyente utilizado para LC varía de disolventes ácidos a básicos. La mayoría de la carcasa de la columna está hecha de acero inoxidable, ya que el acero inoxidable es tolerante a una gran variedad de disolventes. Sin embargo, para el análisis de algunos analitos tales como biomoléculas y compuestos iónicos, no se desea el contacto con el metal, por lo que se emplea en su lugar el alojamiento de la columna de poliéter éter cetona (PEEK).

4.4 Detector
La separación de los analitos se realiza dentro de la columna, mientras que se utiliza un detector para observar la separación obtenida. La composición del eluyente es consistente cuando no hay ningún analito presente. Mientras que la presencia de analito cambia la composición del eluyente. Lo que hace el detector es medir estas diferencias. Esta diferencia se controla como una forma de señal electrónica. Existen diferentes tipos de detectores disponibles. En la lección 6 se explican diferentes tipos de detectores.

4.5 Grabador
El cambio en el eluente detectado por un detector está en forma de señal electrónica, y por lo tanto todavía no es visible a nuestros ojos. En los viejos días, la pluma (papel) – registrador de la carta se utilizó popular. Hoy en día, procesador de datos basado en computadora (integrador) es más común. Hay varios tipos de procesadores de datos; Ejemplos incluyen un sistema simple que consta de impresora incorporada y procesador de textos, y un tipo de computadora personal que consta de monitor de pantalla, teclado e impresora. También hay software que están diseñados específicamente para el sistema LC. Proporciona no sólo la adquisición de datos, sino características como pico de ajuste, corrección de línea de base, cálculo de concentración automática, determinación de peso molecular, etc …

4.6 Degaseador
El eluyente utilizado para el análisis LC puede contener gases como el oxígeno que no son visibles para nuestros ojos. Cuando el gas está presente en el eluyente, éste se detecta como ruido y provoca una línea de base inestable. El método generalmente usado incluye burbujeo (burbujeo de gas inerte), uso de aspirador, sistema de destilación, y / o calentamiento y agitación. Sin embargo, el método no es conveniente y también cuando el disolvente se deja durante un cierto período de tiempo (por ejemplo, durante el análisis largo), el gas se disolverá de nuevo gradualmente. El desgasificador utiliza tubos de membrana de polímero especiales para eliminar los gases. Los numerosos poros muy pequeños en la superficie del tubo de polímero permiten que pase el aire mientras se impide que cualquier líquido pase a través del poro. Colocando este tubo bajo el recipiente de baja presión, creó diferencias de presión dentro y fuera de la tubería (más arriba dentro de la tubería). Esta diferencia permite que el gas disuelto se mueva a través de los poros y retire el gas. En comparación con el tipo de desgaste clásico de desgasificación, el desgasificador se puede utilizar en línea, es más conveniente y eficiente. Muchos de los nuevos sistemas de unidad HPLC contienen un desgasificador.

4.7 Calentador de columna
La separación de LC suele ser influenciada en gran medida por la temperatura de la columna. Con el fin de obtener resultados repetibles, es importante mantener las condiciones de temperatura constante. También para algunos análisis, como el azúcar y el ácido orgánico, se pueden obtener mejores resoluciones a temperatura elevada (50 ~ 80 oC). También es importante mantener la temperatura estable para obtener resultados repetibles, incluso se analiza alrededor de la temperatura ambiente. Hay posibilidades de que pequeñas diferencias de temperatura causen diferentes resultados de separación. Por lo tanto, las columnas se mantienen generalmente dentro del horno de columna (calentador de columna).

5. Otra cromatografía

Otro miembro de la cromatografía, que se utiliza con frecuencia como LC, es la cromatografía de gases (GC). Mientras que LC usa eluyente (flujo generado por un sistema de bombeo), GC utiliza gas (gas portador) suministrado desde un tanque de gas, por lo que no requiere sistema de bombeo. Por lo tanto, el sistema GC es más simple que el sistema LC y por esa razón; Estaba ampliamente disponible antes de que el sistema de LC se hiciera popular. En ese momento, la palabra cromatografía se refiere a GC. El sistema simple de GC era una ventaja pero también una desventaja. Las muestras a analizar necesitan estar en forma gaseosa antes de introducirse en el flujo de gas portador. Por lo tanto, si la muestra original estaba en forma gaseosa, GC es una herramienta conveniente. Sin embargo, la mayoría de la muestra está en forma líquida o sólida y requiere calentamiento a alta temperatura para convertirla en gas. Algunos analitos se alternan por calor, por lo que el método GC no es un ideal para ese caso. El problema relacionado es que GC tiene un límite superior para el análisis de compuestos de gran peso molecular.

En comparación, las muestras líquidas pueden ser analizadas directamente por LC. También si la muestra sólida puede disolverse en un disolvente, puede analizarse por LC. Algunas muestras son insolubles en agua, pero la mayoría de ellas son solubles en disolvente orgánico, hay una alta probabilidad de que podamos encontrar un disolvente que disuelva la muestra. Por lo tanto, LC puede usarse a temperatura ambiente (es decir, sin causar alternancia del analito) para una amplia gama de análisis. Esto hizo que el método LC se volviera más popular que el método GC.

Existen otros tipos de cromatografía tales como cromatografía en capa fina, cromatografía de fluidos supercrítica, cromatografía de papel, etc … pero su uso es aún menos popular que el GC.